Chloroquine 96

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Affiliation: Département de pathologie, Université de l'Oklahoma Health Sciences Center, Oklahoma City, Oklahoma, États-Unis d'Amérique Résumé La chloroquine est un agent antipaludéen établi qui a été récemment testé dans des essais cliniques pour son activité anticancéreuse. apparaît l'effet favorable de la chloroquine être due à sa capacité à sensibiliser les cellules cancéreuses à la chimiothérapie, la radiothérapie, et d'induire l'apoptose. La présente étude a porté sur l'interaction des ions de zinc avec la chloroquine dans une lignée de cellules de cancer de l'ovaire humain (A2780). Chloroquino améliorée absorption du zinc par les cellules A2780, d'une manière dépendante de la concentration, telle que déterminée en utilisant une sonde fluorescente de zinc. Cette amélioration a été atténuée par TPEN, un composé de métal de haute affinité de liaison, ce qui indique la spécificité de l'absorption du zinc. En outre, l'addition d'ions cuivre ou de fer n'a eu aucun effet sur l'absorption du zinc induite par la chloroquine. l'examen au microscope de fluorescence de la distribution intracellulaire de zinc a montré que des ions de zinc libres sont plus concentrés dans les lysosomes, après addition de la chloroquine, ce qui est cohérent avec des rapports antérieurs montrant que la chloroquine inhibe la fonction lysosome. La combinaison de chloroquine avec zinc amélioré chloroquines cytotoxicité et l'apoptose induite dans les cellules A2780. Ainsi chloroquine est un ionophore de zinc, une propriété qui peut contribuer à chloroquines une activité anticancéreuse. Citation: Xue J, Moyer A, B Peng, Wu J, Hannafon BN, Ding W-Q (2014) La chloroquine est un ionophore Zinc. PLoS ONE 9 (10): e109180. doi: 10.1371 / journal. pone.0109180 Editor: Yuan-Soon Ho, Université médicale de Taipei, Taiwan reçus le 25 Juin, 2014 Accepted 10 Septembre, 2014 Publié: 1 Octobre, 2014 Copyright: 2014 Xue et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Paternité. ce qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition de l'auteur et la source originelle sont crédités. Disponibilité des données: Les auteurs confirment que toutes les données sous-jacentes les résultats sont entièrement disponibles sans restriction. Toutes les données pertinentes sont dans le papier. Financement: Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l'American Cancer Society (CNE-117557) Susan G. Komen pour la Fondation Cure (KG081083) le programme NIH OK-INBRE (3P20RR016478-09S2) et le Centre pour la promotion de l'Oklahoma de la science et de la technologie (HR09-025). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit. Intérêts concurrents: Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent. Introduction La chloroquine est un antipaludéen qui a été utilisée chez l'homme depuis de nombreuses années 1. Au cours des dernières années, la chloroquine a été montré pour inhiber autophagy et induire l'apoptose dans les cellules malignes et a donc été testé dans différents systèmes modèles expérimentaux 2 et dans des essais cliniques chez l'homme 3. 4. des études ont démontré que la chloroquine sensibilise les cellules tumorales à la chimiothérapie ou la radiothérapie 5 6 8. Par conséquent, la chloroquine peut éventuellement être un médicament anticancéreux efficace en oncologie clinique. Il a également été démontré que la chloroquine sensibilise les cellules cancéreuses du sein à la chimiothérapie indépendante de autophagy inhibition 9. et les effets secondaires potentiels du traitement à la chloroquine ont également été prudemment discuté 10. 11. Cela indique qu'une compréhension plus détaillée du mécanisme chloroquines anti-cancéreux est nécessaire Afin de développer davantage ce composé dans un agent anticancéreux efficace. Chloroquino exerce un effet pléïotropique dans des cellules eucaryotes, y compris une élévation de pH vacuolaire lorsque piégés dans des organites acides, tels que les lysosomes. Cette augmentation du pH perturbe lysosomale l'acidification conduisant à la dégradation de la fusion et de la dégradation autophagosome autophagique 12. 13. Au niveau moléculaire, la chloroquine a été montré pour agir en synergie avec un inhibiteur de l'Akt pour induire une tumeur mort cellulaire 14. Cependant, notre compréhension de chloroquines l'action au niveau cellulaire et moléculaire dans les cellules cancéreuses est assez limité. Nous avons précédemment rapporté que l'activité anticancéreuse des ions de zinc d'exposition en modifiant lysosome perméabilité de la membrane 15 et par l'intermédiaire de la régulation de l'expression du gène 16. Le zinc des composés, en particulier les ionophores de zinc, de liaison sont un groupe d'agents anticancéreux potentiels qui ciblent le zinc vers les lysosomes et induisent lysosome à médiation l'apoptose des cellules cancéreuses 17. en outre, le rôle du zinc dans la régulation de l'autophagie a récemment été réalisé 18. Alors que les études précédentes ont montré que le métal contenant des complexes de chloroquine peut conduire à une meilleure activité antipaludique 19. son interaction avec des ions de zinc n'a jamais été étudiée dans un système biologique. Compte tenu de l'activité anticancéreuse rapporté des ions de zinc et la chloroquine et leur implication dans les fonctions lysosomales, nous avons cherché à déterminer si des ions de zinc interagissent avec la chloroquine et si cette interaction modifie chloroquines activité anticancéreuse. Nous avons constaté que la chloroquine est un ionophore de zinc, qui cible le zinc vers les lysosomes, et que la combinaison de zinc et de la chloroquine augmente leur cytotoxicité et induit une apoptose dans un système de modèle de cellules cancéreuses humaines. Matériels et méthodes Matériels L'anticorps de la caspase-3 était de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). L'anticorps LC3B-II était de Stressgen (Ann Arbor, MI). L'anticorps PARP était de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). La sonde FluoZin-3 AM et sonde Lysotracker ont été achetés chez Life Technologies Co. (Carlsbad, CA). CellTiter 96 Aqueous Solution (Test MTS) provenait de Promega (Madison, WI). Diphosphate de chloroquine, du chlorure de zinc, le chlorure cuivrique, le chlorure de fer, le N, N, N, N-tétrakis (2-pyridylméthyl) éthylène-diamine (TPEN), Ca-EDTA, l'anticorps ß-actine et d'autres agents chimiques étaient de qualité analytique et achetés chez Sigma ALDRICH (St. Louis, MO). La culture cellulaire L'ovaire A2780 lignée de cellules de carcinome humain était un gentil cadeau du Dr Stephen Howell (Université de Californie, San Diego, CA). A2780 cellules ont été cultivées dans du milieu RPMI 1640 additionné de 10 sérum de veau fœtal, 100 UI / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine. Les cellules ont été cultivées dans un environnement humidifié à 37 ° C, 5 CO 2. et repiquées deux fois par semaine. Les cellules dans 20 passages ont été utilisées dans la présente étude. La viabilité des cellules test viabilité des cellules a été analysée par un dosage au tétrazolium modifié en utilisant un réactif MTS en suivant le protocole du fabricant 15. En bref, les cellules A2780 ont été étalées dans une plaque de culture tissulaire à 96 puits (7,510 3 cellules par puits) dans 100 l de milieu, qui assurer une confluence cellulaire 4060 après 24 heures de croissance. Le milieu a ensuite été remplacé par 100 ul de milieu contenant de la chloroquine frais et de ZnCl 2 à différentes concentrations, et les cellules ont été cultivées pendant les périodes désignées. A chaque puits, 20 l de la solution de MTS a été ajoutée et les cellules ont été incubées à 37 ° C pendant 1 heure pour permettre le développement de la couleur. L'absorbance a été enregistrée à 490 nm et les données ont été exprimées en pourcentage des valeurs obtenues à partir des cellules témoins non traitées. zinc intracellulaire Détection de détection des lysosomes et des ions de zinc libre intracellulaire a été effectuée en utilisant le Lysotracker et FluoZin-3 sondes dans la microscopie à fluorescence suivant les instructions du fabricant 20. Les cellules A2780 ont été ensemencées dans une plaque à 12 puits à une densité de 310 5 cellules par puits . Vingt-quatre heures après l'étalement, les cellules ont été traitées avec de la chloroquine et de ZnCl 2 aux concentrations indiquées pendant 30 minutes. Après le traitement, le milieu est remplacé par du milieu frais (RPMI 1640) contenant 50 nM Lysotracker et / ou 1 M FluoZin-3. Après incubation pendant 30 minutes supplémentaires, le milieu a été éliminé et les cellules ont été lavées trois fois avec du HBSS (solution saline équilibrée de Hanks) et visualisées sur un microscope Nikon Eclipse TE2000-U. Le zinc a été détecté comme un (AM excitation FluoZin-3 490/20 nm et émission 528/38 nm) couleur verte et lysosomes comme une couleur rouge (Lysotracker excitation 555/28 nm et d'émission 617/73 nm). Co-localisation des ions zinc et des lysosomes a été déterminée en fusionnant les images verte et rouge. intensités fluorescentes ont été quantifiés en utilisant le logiciel NIS-Elements AR (Nikon Instruments). mesures du niveau de zinc cellulaire une forme sensible et spécifique de l'indicateur de zinc fluorescent à haute affinité FluoZin-3 a été utilisé pour déterminer les niveaux d'ions de zinc cellulaire 20. La sonde FluoZin-3 a été initialement préparé dans du DMSO (5 mM) et en outre dilué dans le milieu de culture avant l'addition aux cellules. A2780 (110 4 cellules par puits) ont été étalées dans une plaque de 96 puits. Vingt-quatre heures après l'étalement, les cellules ont été traitées avec de la chloroquine pendant 1 heure en présence de ZnCl 2 aux concentrations indiquées. FluoZin-3 (1 M, concentration finale) ont été ajoutés et les cellules ont été incubées pendant encore 30 min à 37 ° C (concentration de DMSO dans le milieu est inférieur à 0,5). Après l'incubation, les cellules ont été lavées deux fois avec du milieu frais pour éliminer tout colorant non spécifiquement associée à la surface cellulaire. moyen additionnel a été ajouté et les cellules ont été incubées pendant encore 30 minutes avant que les mesures de fluorescence ont été effectuées. La fluorescence a été mesurée à 485/535 nm (excitation / émission), en utilisant un Wallac 1420 Multilabel Compteur (Perkin-Elmer Life Sciences, Boston, MA). Une analyse par transfert Western blot Western a été effectuée comme décrit 20 21. En bref, les cellules ont été lysées avec un tampon contenant 50 mM de Tris (pH 7,4), 50 mM de NaCl, 0,5 NP40, 50 mM de NaF, 1 mM de Na 3 VO 4. 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 25 g / ml de leupeptine et 25 g / ml d'aprotinine. Le lysat a été soumis à une sonication sur la glace pendant 6 coups de 10 secondes à chaque fois et on centrifuge à 15000 g pendant 15 min. Les surnageants ont été collectés pour éliminer les matières insolubles. Trente à quarante microgrammes de protéine provenant de chaque échantillon ont été séparés sur un gel de 12 SDS-PAGE, transférés sur une membrane de PVDF, et transférés avec des anticorps dirigés contre la caspase-3, PARP LC3B-II ou de ß-actine. Analyse statistique Toutes les analyses de statistique a été réalisée avec le logiciel GraphPad Prism (San Diego, CA). One-way ANOVA avec l'analyse de Bonferroni a été utilisée pour déterminer les différences entre les groupes témoins et expérimentaux, avec p0.01 que le niveau de signification statistique. Le circuit intégré 50 de la chloroquine, en présence ou en l'absence de ZnCl 2. sur la viabilité cellulaire a été calculée avec une courbe de régression non linéaire (équation de dose-réponse sigmoïdale). Résultats Chloroquine augmente l'absorption du zinc dans les cellules A2780 Pour comprendre si la chloroquine (figure 1) influe sur l'absorption du zinc, les cellules A2780 ont été traitées avec de la chloroquine 100 300 M en présence de concentrations accrues de chlorure de zinc pendant 1 heure. les niveaux de zinc de base intracellulaire étaient à peine détectables dans les cellules de contrôle telle que déterminée en utilisant la sonde FluoZin-3 et un lecteur de plaque fluorescente, comme nous l'avons décrit précédemment 15. 17. L'addition de chlorure de zinc seulement légèrement augmenté les niveaux de zinc intracellulaire suggérant que l'internalisation des ions de zinc est largement limitée par la structure de la membrane cellulaire. Cependant, lorsque la chloroquine ont été ajoutés aux concentrations de zinc intracellulaire moyen de culture ont été considérablement améliorée (figure 2A), ce qui indique que la chloroquine agit comme un ionophore de zinc. Cette amélioration du taux de zinc intracellulaire de la chloroquine a été clairement dépendante de la quantité de chlorure de zinc et de la chloroquine ajoutée (figure 2A). l'examen au microscope de fluorescence en outre démontré que l'absorption de zinc est nettement améliorée par la chloroquine dans ce système de modèle de cellules (figure 2B). Afin de déterminer la spécificité de la détection de zinc intracellulaire, TPEN une affinité élevée perméable composé de liaison de métal membrane établie 22. 23. On a ajouté aux cellules avant l'addition du zinc et de la chloroquine. Comme cela est représenté sur la figure 3A. un prétraitement avec TPEN a significativement atténué l'accumulation intracellulaire de zinc induite par la chloroquine, ce qui indique que la chloroquine apporte du zinc spécifiquement dans les cellules. Ceci a été confirmé par addition de chlorure de fer ou le chlorure de cuivre, qui n'a pas d'incidence sur l'amélioration induite par la chloroquine, des niveaux de zinc intracellulaire (figure 3B). Pour être certain que la chloroquine ne mobilise pas d'ions de zinc à partir des molécules de liaison intracellulaire en zinc, on a prétraité les cellules avec Ca-EDTA, une membrane cellulaire chélateur métallique imperméable, avant l'addition de chloroquine. Comme cela est représenté sur la figure 3A. en présence de Ca-EDTA chloroquine n'a pas amélioré la signalisation intracellulaire de zinc, supportant en outre la conclusion que la chloroquine est un ionophore de zinc. Élargir la figure 1. La structure chimique du composé de chloroquine. sel chloroquine diphosphate a été acheté auprès de Sigma-Aldrich (San Louis, MO, C6628). Plus d'Expand Figure 2. Effets de la chloroquine sur l'absorption d'ions de zinc. UNE . A2780 cellules ont été étalées dans une plaque à 96 puits et traitées avec de la chloroquine (CHQ) seul ou en combinaison avec ZnCl 2 aux concentrations indiquées pendant 1 heure. Le (1 M), la sonde FluoZin-3 a été ajoutée et le signal de fluorescence a été mesurée par excitation à 490/20 nm et une émission à 528/38 nm. Les données (n 3, barres, SEM) sont présentés en pourcentage du niveau le plus élevé de la fluorescence détectée. , P0.01, par rapport à des cellules sans traitement CHQ, en utilisant une ANOVA suivie d'une analyse Bonferroni. B. A2780 cellules ont été étalées dans une plaque à 12 puits et traitées avec ZnCl2 CHQ et à des concentrations indiquées pendant 1 heure. Après addition de la sonde FluoZin-3, les cellules ont été examinées sous un microscope à fluorescence par excitation à 490/20 nm et une émission à 528/38 nm. Montré sont des images représentatives de trois expériences individuelles. Plus d'Expand Figure 3. Effets de CuCl 2. FeCl 2. TPEN et Ca-EDTA sur l'absorption d'ions zinc induite par la chloroquine. UNE . A2780 cellules ont été étalées dans une plaque à 96 puits et prétraités avec TPEN ou Ca-EDTA pendant 15 minutes avant l'addition de la chloroquine (CHQ) et ZnCl 2 aux concentrations indiquées pendant 1 heure. B. A2780 cellules ont été étalées dans une plaque à 96 puits et traitées avec CHQ seul ou en combinaison avec ZnCl 2. CuCl 2. ou FeCl 2 aux concentrations indiquées pendant 1 heure. Le FluoZin-3 AM (1 M) sonde a ensuite été ajouté et le signal fluorescent a été enregistré par excitation à 490/20 nm et émission à 528/38 nm. Les données (n 3, barres, SEM) sont présentés en pourcentage du niveau le plus élevé de la fluorescence détectée. , P0.01, par rapport à la fluorescence détectée dans les cellules sans traitement CHQ, en utilisant une ANOVA suivie d'une analyse Bonferroni. objectifs de chloroquine zinc aux lysosomes Dans notre étude précédente, nous avons démontré que les ionophores métalliques, tels que le clioquinol, apportent des ions de zinc dans les lysosomes des cellules cancéreuses menant à lysosome apoptose médiée 15. Parce que la chloroquine est un lysosomale établi l'agent 12. 13 ciblage. 24. nous avons examiné la distribution de zinc intracellulaire après traitement de cellules A2780 avec la chloroquine et le zinc. Comme cela est représenté sur la figure 4. chloroquine accumulation, induite par des ions de zinc intracellulaire principalement dans les lysosomes, comme en témoigne la co-localisation des signaux fluorescents de FluoZin-3 et Lysotracker. Clioquinol, un ionophore de zinc établi qui cible le zinc lysosomes 15. On a utilisé comme témoin positif (figure 4B). Ainsi, la chloroquine est un ionophore de zinc qui cible zinc vers les lysosomes cellulaires. Développer Figure 4. Distribution d'ions de zinc intracellulaire dans les cellules A2780 après le traitement à la chloroquine. UNE . cellules A2780 ont été étalées dans une plaque de 6 puits et traités avec la chloroquine (CHQ) et ZnCl 2 aux concentrations indiquées pendant 1 heure. Après addition des sondes FluoZin-3 et Lysotracker, les cellules ont été examinées par microscopie confocale (excitation, 490/20 nm, émission 528/38 nm pour FluoZin-3 555/28 nm, 617/73 nm pour Lysotracker, respectivement) . Montré sont des images représentatives de trois expériences individuelles. B. A2780 cellules ont été étalées dans une plaque à 12 puits et traitées avec le clioquinol (CQ) et ZnCl 2 aux concentrations indiquées pendant 1 heure. Les images confocales ont été capturés comme nous l'avons décrit précédemment 17. Les ions zinc améliorent chloroquines cytotoxicité Afin de déterminer si l'addition du zinc et de la chloroquine peut tuer plus efficacement les cellules cancéreuses, les cellules A2780 ont été traitées avec des concentrations croissantes de chloroquine, en présence de 25 M de chlorure de zinc pendant 72 heures. Analyse de viabilité cellulaire a indiqué que des ions de zinc amélioré de manière significative chloroquines cytotoxicité dans ce système de modèle (figure 5A). Le circuit intégré 50 de la chloroquine, qui est typiquement d'environ 22310 M dans des cellules A2780, a été réduite à 1,019 M en présence de chlorure de 25 M de zinc. En outre, la combinaison de la chloroquine et de traitement de zinc amélioré de manière significative la mort cellulaire apoptotique comme le montre la caspase-3 activation et le clivage de PARP (figure 5B). des ions de zinc a également amélioré l'activité inhibitrice chloroquines autophagy comme indiqué par la détection LC3B-II (figure 5B). Développer Figure 5. Effets de la chloroquine et de zinc sur la caspase 3 activation et l'expression LC3B-II. les cellules A2780 ont été traités avec de la chloroquine (CHQ) ou ZnCl 2. seul ou en combinaison aux concentrations indiquées. Les lysats cellulaires ont été préparés et western blot a été réalisée en utilisant des anticorps primaires contre pro-caspase 3, LC3B-II, PARP, et actine. Montré sont blots représentatifs de trois expériences individuelles. Discussion La nouvelle découverte de la présente étude est que la chloroquine est un ionophore de zinc, ce qui contribue à notre compréhension de chloroquines d'activité biologique dans les cellules cancéreuses humaines. Alors que la chloroquine a été étudiée dans la recherche biomédicale 12. 13 et utilisé pour le traitement du paludisme 1 et d'autres maladies humaines 25. 26. Cette activité du composé n'a pas été précédemment rapporté. La conclusion selon laquelle la chloroquine est un ionophore de zinc est basé sur la détection des niveaux de zinc intracellulaire significativement élevés lorsque le zinc et la chloroquine ont été ajoutés au milieu de culture cellulaire. La sonde de zinc fluorescente utilisée dans cette étude est un marqueur intracellulaire bien établie pour les ions de zinc et a été validé dans des études précédentes pour la détection de zinc spécifique 15. 27. 28. Dans la présente étude, la spécificité de détection de zinc a été confirmée par l'utilisation de TPEN, une affinité composé 22. qui a bloqué l'absorption de zinc induite par la chloroquine liaison métallique haute. Par ailleurs, en présence de Ca-EDTA, une membrane imperméable chélateur métallique, la chloroquine n'a pas augmenté les taux de zinc intracellulaire, ce qui indique qu'elle apporte en particulier le zinc extracellulaire dans les cellules afin d'améliorer les niveaux de zinc intracellulaire. Fait intéressant, l'addition d'ions fer ou de cuivre n'a pas d'incidence sur l'absorption du zinc induite par la chloroquine, ce qui indique en outre que la chloroquine peut essentiellement agir comme ionophore de zinc. L'affinité de liaison d'un composé métallique pour différents métaux peuvent considérablement différer 29. Par conséquent si la chloroquine agit également comme un ionophore pour d'autres ions métalliques tels que le cuivre et le fer reste à déterminer. Les concentrations molaires des métaux utilisés dans cette étude ont été basées sur nos rapports précédents 15. 23. Bien que l'affinité de liaison de la chloroquine pour divers ions métalliques doit être définie en outre, l'activité ionophore de zinc de ce composé fournit une nouvelle compréhension de la façon dont la chloroquine, en présence de zinc, peut exercer ses effets anticancéreux. Nous avons précédemment rapporté que des composés tels que le clioquinol de liaison du métal, la cible de zinc lysosomes induisant ainsi l'apoptose 15. La même chose semble être le cas pour la chloroquine, comme en témoigne la co-localisation de zinc avec le lysosome et l'induction de l'apoptose lorsque les cellules étaient traité avec la combinaison de la chloroquine et de zinc. Ces données suggèrent que le clioquinol et la chloroquine peut en partie la part d'un mécanisme similaire dans leur action anticancéreuse. Les deux composés sont actuellement utilisés chez les humains pour d'autres indications 25. 26. 30 et ont prouvé une activité anticancéreuse dans des systèmes modèles expérimentaux 6 8. 20. Le fait que les actes de chloroquine comme un ionophore de zinc encore appuie notre demande récente que ionophores métalliques sont une nouvelle groupe de composés anticancéreux, qui méritent une exploration plus poussée 17. Il est intéressant de noter que la combinaison de la chloroquine et de zinc modifie les taux de protéine LC3B-II dans notre système modèle, ce qui indique que le zinc affecte chloroquines effet inhibiteur sur autophagy. Le fait que le zinc améliore également l'apoptose induite par la chloroquine dans des cellules A2780 suggère que l'inhibition de l'autophagie et l'induction de l'apoptose par la chloroquine est vraisemblablement un événement séquentiel dans ce système modèle. Ceci est cohérent avec l'observation que l'inhibition de l'autophagie cellulaire conduit à des résultats pro-apoptotiques dans les cellules cancéreuses humaines 31. En conclusion, nous avons identifié la chloroquine comme un ionophore de zinc, ce qui révèle un nouvel aperçu de l'activité chloroquines anticancéreux. Étant donné que la chloroquine et le zinc sont considérés comme des agents anticancéreux potentiels, la combinaison des deux peut être une nouvelle stratégie pour développer des approches plus efficaces dans la gestion du cancer. Contributions des auteurs Conçu et développé les expériences: JX AM WQD. Joué les expériences: JX AM BNH BP. Analyser les données: JX AM BNH JW WQD. Apportés réactifs / matériaux / outils d'analyse: JW WQD. A écrit le papier: JX BNH WQD. Références 1. Krafts K, Hempelmann E, Skorska-Stania A (2012) De bleu de méthylène à la chloroquine: un bref examen de la mise au point d'un traitement antipaludique. Parasitol Res 111: 16. 2. 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